· poliakrilamidGel mora biti sestavljen iz akrilamidnega monomera, izhodnega materiala za polimerizacijo, katalizatorja in mešanice soli in pufra.
· akrilamidin BIS (N, N'-metilenski dvojni akrilamid) je monomer v obliki gelske matrike.
· amonijev persulfat sproži postopek polimerizacije lepila. Za pripravo lepila je potrebna 10-odstotna raztopina amonijevega persulfata, pripravljena v vodi. Večina informacij je kazala na potrebo po aktivni uporabi. Vendar pa lahko 10-odstotno raztopino hranimo pri 4 °C več tednov brez znatne izgube aktivnosti. Dopolnimo do 10 ml in zavržemo, ko se lepilo ne strdi.
Nasvet: OdstotekakrilamidPri sekvenciranju lepilo in beljakovinsko lepilo nista ista stvar. Če uporabljate vnaprej pripravljeno raztopino akrilamida:BIS, poskrbite, da boste imeli pravo stekleničko.
· TEMED (N, N, N ', N '- tetrametil etilendiamin) je katalizator v rjavi steklenici, postavljeni v hladilnik. Dodajte tik pred vlivanjem lepila.
· Steklo, uporabljeno pri elektroforezi s poliakrilamidom, je treba pred in po vsaki uporabi oprati. Po elektroforezi ga operite z mehko krtačo in krpo v vroči milnici, sperite z destilirano vodo in pustite, da se posuši.
· Vlaga in prah lahko povzročita votli polimer. Pred elektroforezo stekleno ploščo očistite s čistilom za steklo in jo obrišite z mehko krtačo. Operite z destilirano vodo in temeljito posušite s papirnato krpo. Izpiranje s 70 % etanolom pred brisanjem s papirjem pomaga očistiti in pospešiti sušenje. Zaporedoma dodajte vzorce akrilamida: BIS, vodo, pufersko raztopino, amonijev persulfat, TEMED. Dobro pretresite in takoj prelijte.
Pred polimerizacijo poliakrilamida ni potrebno razpliniti. (Akrilamid so včasih dajali v vakuum, da so odstranili mehurčke, ker kisik zavira polimerizacijo.)
Vzorčne konice za vodoravne lepilne točke.
· V spodnjo škatlo položite kos črnega papirja s črno podlago, da naredite nekaj luknjic za vzorec, da boste bolje videli.
· pufer, napolnjen z rezervoarjem za lepilo, tik nad koloidom.
· če ima rob lučko, prižgite lučke in pustite, da svetloba sije koloidno. Vzorec potegnite v pipeto.
· z uporabo avtomatske pipete.
· pri 10–200 mu se lahko v večini točk na vzorcu uporabi 1 tekoča premična točka. Za zelo majhne luknje v vzorcu (manjše od 10 μ1) je za sekvenciranje lepila bolj priročna dolga glava pipete.
· pipetiranje tik ob potopitvi v vzorec, vdihavanje počasi premikajoče se tekočine. Vzorec je lahko zaradi glicerina videti lepljiv, hitro črpanje pa lahko v glavo pipete potegne zračne mehurčke.
· Po vdihu vzorcev s pipeto nežno premaknite glavo tekočine po robu cevi ali pa s papirjem za brisanje posesajte glavo tekočine iz kapljic. Pazite, da ne posesate vzorca.
Vzorec postavite v vzorčno luknjo
· pipetna naprava za vzdrževanje rahlega pritiska, da vzorci rahlo premaknejo prelivno tekočinsko glavo.
· glava pipete, vstavljena v pufer, nekoliko višje od luknjic za pike, vzdržuje pozitivni tlak. Konico pipete lahko vstavite v majhno luknjico.
· počasi in enakomerno izvlecite vzorce. Konico pipete namestite nad odprtino za vzorec in vzorec se bo potopil v odprtino. Namesto da vzorec potisnete vanjo, pustite, da se pogrezne, da zapolni odprtino.
· Ko zadnja kapljica vzorca pade s tekoče glave, se bo tekočina premaknila na drugo nogo, počasi dvignila tekočino in se premaknila iz pufra
Kako narediti vertikalno vzorčenje lepila?
· navpične luknje za vzorec z lepilnimi točkami, ki so nastale med dvema kosoma stekla. Pri zelo redkem lepilu glave pipete sploh ni mogoče vstaviti med dve stekleni plošči. Pazite na glicerin! Glavo pipete položite čez luknjo za vzorec in vzorec se bo potopil v luknjo.
· Pred odvzemom vzorca se prepričajte, da je navpična točka polipropilenskega acilnega gela v odprtini za vzorec do čista. Izperite nepolimeriziran akrilamid in vodo, ki se lahko pojavi na dnu odprtine za vzorec. Voda lahko znatno zmanjša odprtino za vzorec. Uporabite 25 ml ali 50 ml brizgo in iglo kalibra 18. Vlijte elektroforezni pufer in previdno sperite odprtino za vzorec.
· Odprtino za vzorec je lahko težko videti, vendar je vse ostalo enostavno. Če je preveč odprtin, lahko vzorčni pufer preizkusite z bromofenol modrim.
Čas objave: 31. marec 2023