· poliakrilamidgel mora z akrilamidnim monomerom, izhodnim materialom za polimerizacijo, katalizatorjem ter mešanico soli in pufra skupaj.
· akrilamidin BIS (N, N'- metilen dvojni akrilamid) je matrica gela v obliki monomera.
· amonijev persulfat sproži proces polimerizacije lepila.Formulacija lepila zahteva 10% raztopino amonijevega persulfata, pripravljeno v vodi.Večina informacij je kazala na potrebo po aktivni uporabi.Vendar pa lahko 10-odstotno raztopino postavite na 4 ℃ več tednov brez znatne izgube aktivnosti.Dopolnite do 10 ml in zavrzite, ko se lepilo ne strdi.
Namig: odstotekakrilamidpri sekvenciranju lepilo in proteinsko lepilo nista enaka.Če uporabljate pripravljeno raztopino akrilamida: BIS, poskrbite, da boste dobili pravo steklenico.
· TEMED (N,N,N',N'- tetrametil etilendiamin) je katalizator, v rjavi steklenički, shranjen v hladilniku.Dodajte tik pred vlivanjem lepila.
· elektroforezo s poliakrilamidom Steklo, ki se uporablja pri elektroforezi, je treba oprati pred in po vsaki uporabi.Po elektroforezi operite z mehko krtačo in krpo v vroči vodi z milom, sperite z destilirano vodo in pustite, da se posuši.
· vlaga in prah lahko povzročita votli polimer.Pred elektroforezo stekleno ploščo očistite s čistilom za steklo in obrišite z mehko krtačo.Operite z destilirano vodo in temeljito osušite s papirnato krpo.Izpiranje s 70% etanolom pred brisanjem s papirjem pomaga očistiti in pospešiti sušenje.Zaporedoma dodajte vzorce akrilamida: BIS, vodo, pufrsko raztopino, amonijev persulfat, TEMED.Dobro pretresite in takoj prelijte.
Poliakrilamida pred polimerizacijo ni treba razpliniti.(Akrilamid so dajali v vakuum, da so odstranili mehurčke, ker kisik zavira polimerizacijo.)
Konice vzorcev vodoravnih lepilnih točk.
· dajte kos črnega papirja v spodnjo škatlo, črno ozadje, da naredite luknjo za vzorec, da boste bolje videli.
· pufer, napolnjen z rezervoarjem za lepilo, tik nad koloidom.
· če ima rob luč, prižgite luči, naj svetloba sveti koloidno.Povlecite vzorec v pipeto.
· z uporabo avtomatske naprave za pipetiranje.
· v 10-200 mu 1 gibljivo točko tekočine lahko uporabite v večini točk na vzorcu.Za zelo majhne vzorčne luknje (manj kot 10 μ1) je primernejša dolga glava pipete, ki se uporablja za sekvenciranje lepila.
· pipetiranje pravkar potopljenega v vzorec, vdihavanje počasi premikajoče se tekočine.Vzorec se lahko zdi lepljiv zaradi glicerina in hitro črpanje lahko potegne zračne mehurčke v glavo pipete.
· vzorci po vdihavanju glave za pipetiranje nežno premikajo glavo tekočine po robu cevi ali brisalni papir posrkajo glavo tekočine zunaj kapljic.Pazite, da ne posesate vzorca.
Postavite vzorec v luknjo za vzorec
· naprava za pipetiranje, ki ohranja majhen pritisk, poskrbi, da se vzorci rahlo premaknejo v glavo pretočne tekočine.
· glava za pipetiranje, vstavljena v pufer, nekoliko višje od točkovnih lukenj, vzdržuje pozitiven tlak.Konico pipete lahko vstavite v majhno luknjo.
· počasi in enakomerno odtekajo vzorci.Konico pipete postavite nad luknjo za točkovni vzorec in vzorec bo potonil v luknjo.Pustite, da se vzorec potopi, da zapolni luknjo za vzorec, namesto da ga potisnete noter.
· ko pride zadnja kapljica vzorca s tekočo glavo, se tekočina premakne na drugo nogo, počasi dvignite tekočino, premaknite se iz pufra
Kako narediti vertikalno vzorčenje lepila?
· navpične lepilne točke vzorčne luknje, oblikovane med dvema kosoma stekla.Pri zelo tankem lepilu glave pipete sploh ni mogoče vstaviti med dve stekleni plošči.Pazi na glicerin!Postavite glavo pipete nad luknjo za vzorec in vzorec se bo potopil v luknjo.
· Točkovni vzorec pred, se prepričajte, da postavite navpično točko polipropilen acilnega gela, luknjo za vzorec speremo.Odstranite nepolimerizirani akrilamid in vodo, ki se lahko pojavita na dnu luknje za vzorec.Voda lahko bistveno zmanjša luknjo za vzorec.Uporabite 25 ml ali 50 ml brizgo in iglo G. 18.Nalijte pufer za elektroforezo in previdno izperite luknjo za vzorec.
· morda je težko videti luknjo za vzorec, vendar je ostalo enostavno.Če so luknje odvečne, lahko pufer za vzorec testirate z bromofenol modrim.
Čas objave: 31. marca 2023